Исследователи из института Гладстона (Gladstone Institutes) разрабатывают новую технологию для изучения факторов, которые могут привести к гибели клеток, в том числе при нейродегенеративных заболеваниях.
Актуальность исследования
Трудно сказать, когда клетка мозга мертва. Нейроны, которые кажутся неактивными и фрагментированными под микроскопом, могут сохраняться в подвешенном состоянии жизни или смерти в течение нескольких дней, а некоторые внезапно начинают сигнализировать снова после того, как кажутся инертными. Для исследователей, изучающих нейродегенерацию, это отсутствие точного определения “времени смерти” для нейронов затрудняет определение того, какие факторы приводят к гибели клеток, и выявление препаратов, которые могли бы спасти стареющие клетки от смерти.
Новизна исследования
Теперь исследователи разработали новую технологию, которая позволяет им отслеживать тысячи клеток одновременно и определять точный момент смерти для любой клетки. В статье, опубликованной в журнале Nature Communications, команда показала, что этот подход работает в клетках грызунов и человека, а также в живых рыбах, и может использоваться для наблюдения за клетками в течение нескольких недель или месяцев.
«Получение точного времени смерти очень важно для выяснения причин и следствий при нейродегенеративных заболеваниях», – заявляет Стив Финкбайнер (Steve Finkbeiner), автор исследования. «Это позволяет нам выяснить, какие факторы непосредственно вызывают гибель клеток, какие являются случайными, а какие могут быть механизмами преодоления, которые задерживают смерть».
Машинное обучение
В сопутствующей статье, опубликованной в журнале Science Advances, исследователи объединили технологию клеточных датчиков с подходом машинного обучения, обучая компьютер тому, как различать живые и мертвые клетки в 100 раз быстрее и точнее человека.
«Студентам колледжа потребовались месяцы, чтобы проанализировать такие данные вручную, и наша новая система работает почти мгновенно — на самом деле она работает быстрее, чем мы можем получать новые изображения с помощью микроскопа», – утверждает Джереми Линсли (Jeremy Linsley,) руководитель научной программы.
Когда клетки умирают — независимо от причины или механизма — они в конечном итоге становятся фрагментированными, а их мембраны дегенерируют. Но этот процесс деградации требует времени, из-за чего ученым трудно различать клетки, которые давно перестали функционировать, больные и умирающие, и здоровые.
Исследователи обычно используют флуоресцентные метки или красители, чтобы следить за больными клетками с помощью микроскопа с течением времени и пытаться диагностировать, где они находятся в процессе деградации. Многие индикаторные красители, пятна и этикетки были разработаны для того, чтобы отличать уже мертвые клетки от тех, которые все еще живы, но они часто работают только в течение коротких периодов времени до выцветания, а также могут быть токсичными для клеток при их нанесении.
«Мы хотели, чтобы индикатор действовал в течение всей жизни клетки, а не только в течение нескольких часов, а затем давал четкий сигнал только после определенного момента, когда клетка умирает», — говорит Линсли.
Кальций и смерть клетки
Исследователи кооптировали датчики кальция, первоначально разработанные для отслеживания уровня кальция внутри клетки. Когда клетка умирает и ее мембраны становятся негерметичными, одним из побочных эффектов является то, что кальций устремляется в водянистый цитозоль клетки, в котором обычно содержится относительно низкий уровень кальция. Линсли спроектировал датчики кальция так, чтобы они находились в цитозоле, где они будут флуоресцировать только тогда, когда уровень кальция повышается до уровня, указывающего на гибель клеток. Новые датчики, известные как генетически закодированный индикатор смерти (ГЗИС), могут быть вставлены в клетки любого типа и сигнализировать о том, что клетка жива или мертва в течение всей жизни клетки.
Результаты исследования
Чтобы проверить полезность переработанных датчиков, группа поместила под микроскоп большие группы нейронов, каждая из которых содержала ГЗИС. После визуализации более миллиона клеток, в некоторых случаях склонных к нейродегенерации, а в других подверженных воздействию токсичных соединений, исследователи обнаружили, что датчик ГЗИС был намного более точным, чем другие индикаторы гибели клеток: не было ни одного случая, когда датчик был активирован и клетка оставалась живой. Более того, в дополнение к этой точности, ГЗИС также обнаруживал гибель клеток на более ранней стадии, чем предыдущие методы, — близко к “точке невозврата” для гибели клеток.
«Это позволяет вам отделять живые и мертвые клетки так, как никогда раньше не было возможно, – говорит Линсли.
BO-CNN
Линсли рассказал о ГЗИС своему брату — Дрю Линсли (Drew Linsley), сотруднику Университета Брауна (Brown University), который специализируется на применении искусственного интеллекта к крупномасштабным биологическим данным. Его брат предложил использовать датчик в сочетании с подходом машинного обучения, чтобы научить компьютерную систему распознавать живые и мертвые клетки мозга, основываясь только на форме клетки. Команда объединила результаты нового датчика со стандартными данными флуоресценции на тех же нейронах, и они научили компьютерную модель, называемую BO-CNN, распознавать типичные паттерны флуоресценции, связанные с тем, как выглядят умирающие клетки. Эта модель, как показали братья Линсли, была на 96 процентов точной и лучше, чем то, что могут сделать наблюдатели-люди, и была более чем в 100 раз быстрее, чем предыдущие методы дифференцировки живых и мертвых клеток.
«Для некоторых типов клеток человеку чрезвычайно трудно определить, является ли клетка живой или мертвой, но наша компьютерная модель, обучаясь у ГЗИС, смогла различать их на основе частей изображений, которые, как мы ранее не знали, были полезны для различения живых и мертвых клеток», — говорит Джереми Линсли.
Практическая значимость работы
Теперь BO-CNN позволят ученым проводить новые, высокопроизводительные исследования, чтобы выяснить, когда и где умирают клетки мозга – очень важная конечная точка для некоторых из наиболее важных заболеваний. Они также могут проверять препараты на их способность задерживать или предотвращать гибель клеток при нейродегенеративных заболеваниях. Или, в случае рака, они могут искать лекарства, которые ускоряют гибель больных клеток.
«Эти технологии меняют правила игры в нашей способности понимать, где, когда и почему в клетках происходит смерть», – заключает Финкбайнер. «Впервые мы можем по-настоящему использовать скорость и масштаб, предоставляемые достижениями в области роботизированной микроскопии, для более точного обнаружения гибели клеток и сделать это задолго до момента смерти. Мы надеемся, что это может привести к более специфической терапии многих нейродегенеративных заболеваний, которые до сих пор были неизлечимы».
Авторы нового исследования утверждают, что ранняя гибель нервных клеток имеет решающее значение для формирования здорового мозга.
