Капельная цифровая полимеразная цепная реакция и секвенирование нового поколения решают разные задачи при изучении инфекций. Первый метод позволяет обнаруживать и точно подсчитывать небольшое количество заранее известного генетического материала, второй — читать последовательность вирусного генома, искать мутации и оценивать реакцию организма. Совместное применение технологий может дать более полную картину действия противовирусного препарата.
Эти возможности обсуждались в коммерческом интервью, которое провела Мередит Лэндри (Meredith Landry). В беседе участвовали Крис Форсдайк (Chris Forsdyke), Мартин Ларк (Martin Larke), Франческа Манни (Francesca Manni) и Челси Пратт (Chelsea Pratt), представляющие лабораторную компанию и производителей оборудования.
Материал не является рецензируемым исследованием и не содержит независимого сравнения приборов. Приведённые характеристики производительности и стоимости следует рассматривать как заявления представителей компаний.
Зачем нужны молекулярные методы
При разработке противовирусного средства исследователям необходимо ответить на несколько вопросов. Присутствует ли возбудитель в образце? Сколько его там? Меняется ли вирус во время лечения? Возникают ли генетические варианты, способные снизить чувствительность к препарату? Как на терапию реагирует иммунная система пациента?
Один лабораторный метод обычно не способен дать все эти сведения.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) обнаруживает заранее выбранный участок дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК). Секвенирование позволяет прочитать более протяжённую последовательность генетического материала и найти изменения, которые исследователи заранее не искали.
Поэтому технологии могут дополнять, а не заменять друг друга.
Чем цифровая ПЦР отличается от обычной
Количественная полимеразная цепная реакция (quantitative polymerase chain reaction, qPCR) проводится в одной пробирке. При каждом цикле копирования генетического материала прибор измеряет флуоресцентный сигнал — свечение, интенсивность которого увеличивается по мере накопления продукта реакции.
Чтобы определить количество исходного материала, результат обычно сравнивают с калибровочной кривой, построенной по образцам с заранее известной концентрацией. Точность зависит от эффективности копирования и качества контрольных материалов.
При капельной цифровой полимеразной цепной реакции (droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR) смесь разделяется на тысячи микроскопических капель. В одних каплях оказывается искомый участок ДНК или РНК, в других его нет.
После реакции прибор подсчитывает положительные и отрицательные капли. Концентрацию рассчитывают с помощью распределения Пуассона — статистической модели, учитывающей вероятность попадания одной или нескольких молекул в отдельную каплю.
Такой подход позволяет получить абсолютное количество копий без построения стандартной кривой.
Когда разделение на капли особенно полезно
Цифровая ПЦР может быть удобна при поиске редких генетических последовательностей на фоне большого количества другого материала.
В обычной реакции слабый сигнал иногда оказывается близок к уровню отрицательного контроля, из-за чего трудно отличить небольшое количество мишени от случайного свечения. Разделение образца позволяет изолировать редкие молекулы в отдельных каплях и уменьшить их конкуренцию с более распространёнными последовательностями.
Метод также может быть менее чувствителен к некоторым веществам, мешающим реакции. Однако это не означает полной устойчивости к загрязнению или неправильной подготовке образца.
Результат по-прежнему зависит от качества выделения нуклеиновых кислот, конструкции реагентов, соблюдения температурного режима и контроля возможного переноса материала между образцами.
Коклюш показывает трудности молекулярной диагностики
В интервью в качестве примера рассматривалась бактерия Bordetella pertussis, вызывающая коклюш.
Бактериологический посев позволяет подтвердить присутствие живого возбудителя, но бактерия растёт медленно и требовательна к условиям транспортировки. Молекулярный анализ может дать результат значительно быстрее, особенно в начале заболевания.
Основная сложность заключается в выборе генетической мишени.
Некоторые лабораторные тесты направлены на повторяющиеся вставочные последовательности, которые присутствуют в геноме бактерии во множестве копий. Это повышает чувствительность: даже при небольшом количестве возбудителя в образце вероятность обнаружения остаётся высокой.
Однако похожие последовательности могут встречаться у нескольких представителей рода Bordetella. В таком случае положительный результат не всегда позволяет уверенно определить конкретный вид.
Более специфичные участки, например связанные с промотором гена коклюшного токсина, представлены меньшим числом копий. Они помогают точнее различать бактерии, но могут снизить чувствительность анализа.
Один из возможных выходов — многокомпонентный тест, который одновременно проверяет несколько генетических мишеней. Интерпретировать его должен специалист с учётом симптомов, срока заболевания и качества клинического образца.
Что добавляет секвенирование нового поколения
Секвенирование нового поколения (next-generation sequencing, NGS) позволяет одновременно читать большое количество фрагментов ДНК или РНК.
Сначала генетический материал извлекают из клинического образца. Если исследуется РНК-содержащий вирус, РНК обычно превращают в комплементарную ДНК. Затем из фрагментов создают так называемую библиотеку — подготовленный набор молекул, пригодных для чтения прибором.
После секвенирования исследователи получают множество коротких последовательностей. Компьютерная программа сопоставляет их с эталонным геномом и выявляет отличия.
Так можно определить:
- вариант возбудителя;
- однонуклеотидные изменения — замены одной генетической «буквы»;
- небольшие вставки и удаления;
- сочетания мутаций;
- долю определённого варианта в образце;
- участки генома с недостаточной глубиной чтения.
Глубиной называют количество независимых прочтений одного участка. Чем она выше, тем увереннее можно отличить реальный вариант от технической ошибки, хотя сама по себе большая глубина не устраняет все источники неточности.
Почему важно правильно выбрать эталонный геном
Вирусы постоянно меняются. Если последовательность клинического образца сравнить только со старым эталонным штаммом, анализ может выявить множество различий, накопившихся в популяции задолго до исследования препарата.
Такие варианты отражают естественную эволюцию вируса и не обязательно связаны с лечением.
По словам участников интервью, для анализа противовирусной устойчивости полезно использовать данные о штаммах, циркулировавших в тот же сезон. Тогда исследователям проще сосредоточиться на изменениях, которые появились или увеличили свою долю уже во время терапии.
Особенно важно сопоставлять результаты, полученные до начала лечения, во время приёма препарата и после него.
Обнаруженная мутация сама по себе не доказывает лекарственную устойчивость. Необходимо установить, изменяет ли она чувствительность вируса в лабораторных опытах, возникает ли под давлением препарата и связана ли с ухудшением клинического ответа.
Как цифровая ПЦР и секвенирование работают вместе
Капельная цифровая ПЦР отвечает прежде всего на вопрос: «Сколько копий известной мишени присутствует в образце?»
Секвенирование помогает ответить на другой вопрос: «Какие последовательности находятся в образце и чем они отличаются от эталона?»
При совместном использовании цифровая ПЦР может применяться для быстрого и чувствительного подсчёта вирусного материала, а секвенирование — для подробного изучения генома и поиска вариантов устойчивости.
Возможная схема выглядит следующим образом:
- Из клинического образца выделяют ДНК или РНК.
- Цифровая ПЦР определяет концентрацию выбранной мишени.
- Образцы с достаточным количеством материала направляют на секвенирование.
- Компьютерный анализ восстанавливает вирусный геном и выявляет варианты.
- Результаты сопоставляют со временем лечения, дозой препарата и состоянием участника исследования.
Это может уменьшить число малоинформативных запусков секвенатора и одновременно сохранить возможность выявлять редкие или неожиданные изменения.
Автоматизация не заменяет контроль качества
В интервью большое внимание уделялось автоматической подготовке образцов и библиотек.
Роботизированные системы могут выполнять повторяющиеся операции с небольшими объёмами жидкости, выдерживать время реакций и снижать различия между действиями отдельных сотрудников. Это особенно важно при обработке сотен образцов.
Однако автоматизация не гарантирует правильного результата. Ошибка в расположении образцов, загрязнение исходного материала или неверно составленный рабочий протокол могут систематически повлиять сразу на всю серию.
До секвенирования необходимо оценить количество и качество подготовленной библиотеки. После него требуется проверить глубину чтения, равномерность покрытия генома, уровень загрязнения и качество отрицательных контролей.
Лаборатория также должна заранее определить критерии, по которым результат будет признан пригодным или отклонён.
Секвенирование РНК показывает реакцию организма
Секвенирование можно направить не только на геном возбудителя, но и на РНК клеток человека.
РНК отражает активность генов: если определённая генетическая программа включается, клетка производит больше соответствующих молекул РНК. Одновременный анализ тысяч генов называют транскриптомным профилированием.
Такой подход позволяет оценить не один белок воспаления, а целую систему взаимосвязанных реакций. Например, исследователи могут увидеть одновременное ослабление воспалительных путей, изменение противовирусного ответа и усиление программ клеточной гибели.
Результаты часто объединяют в наборы генов, связанных с определёнными биологическими процессами. Это помогает выдвигать предположения о механизме действия лекарства и находить возможные биомаркеры ответа.
Однако изменение активности генов не всегда приводит к соответствующему изменению количества белка или состояния пациента. Выводы транскриптомного анализа необходимо подтверждать другими лабораторными и клиническими данными.
Контролируемое заражение даёт точную временную шкалу
Участники интервью обсуждали применение молекулярных технологий в исследованиях с контролируемым заражением добровольцев.
В таких проектах тщательно отобранным участникам в контролируемых условиях вводят заранее охарактеризованный штамм возбудителя. Затем исследователи регулярно берут образцы и наблюдают за симптомами, иммунным ответом и действием препарата.
Преимущество заключается в том, что время заражения известно. Это позволяет точнее сопоставлять количество вируса, появление мутаций и изменения активности генов с началом инфекции и приёмом лекарства.
Такие исследования подходят не для каждого возбудителя и проводятся только после этической оценки, при наличии подробного информированного согласия и возможности лечения или контроля инфекции. Их результаты также не всегда полностью воспроизводят естественное заражение среди людей разного возраста и состояния здоровья.
Что важно учитывать при чтении интервью
Обсуждение отражает точку зрения представителей компаний, заинтересованных в использовании лабораторных платформ и услуг. В материале не представлены результаты клинического испытания, сравнительные данные нескольких производителей или независимый экономический анализ.
Заявления о снижении стоимости, ускорении обработки и повышении производительности зависят от количества образцов, числа мишеней, используемых реагентов, квалификации сотрудников и требований к подтверждению результата.
Цифровая ПЦР не является автоматически более подходящей для любой задачи, чем количественная ПЦР. Секвенирование также не заменяет быстрые целевые тесты, если врачу нужно оперативно подтвердить конкретную инфекцию.
Выбор метода должен определяться клиническим или исследовательским вопросом, а анализ — проходить проверку пригодности для конкретного вида образца и возбудителя.
Молекулярные технологии могут быть особенно полезны при поиске небольших популяций вируса, сохраняющихся несмотря на лечение. Например, исследователи разрабатывают способы выявлять скрытые резервуары вируса иммунодефицита человека, которые стандартная терапия не устраняет полностью.
Литература
Landry M. Interview with Forsdyke C., Larke M., Manni F., Pratt C. // News-Medical. – Sponsored content.